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哺乳動物細胞蛋白表達案例

發表時間:2022-01-22 訪問次數:805

一、實驗設計

  根據客戶的預期蛋白量、純度以及蛋白用途等需求,通過哺乳系統來分泌表達純化目的蛋白。設計思路為:密碼子優化最適宜哺乳系統的基因序列,將目的蛋白序列構建到普健生物自主研發的高效表達載體pATX2,N端添加哺乳系統常用信號肽利于分泌表達,C端添加His標簽,便于蛋白的檢測和親和純化,瞬時轉染哺乳細胞HEK293,通過SDS-PAGE檢測蛋白表達情況,收集培養基部分用鎳柱親和純化獲得目的蛋白。

二、蛋白性質分析

  2.1信號肽分析

哺乳動物細胞蛋白表達純化服務案例

  2.2疏水性分析

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  2.3跨膜結構域分析

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  綜上所述:

  1.目的蛋白理論分子量為 43KDa,適宜表達。

  2.對蛋白的信號肽,跨膜結構域和親疏水性分析,蛋白整體疏水性略強。

  3.目的蛋白自身無信號肽,添加哺乳系統常用信號肽,利于蛋白分泌表達。

  4.在C端添加His標簽,便于蛋白的檢測和親和純化。

三、實驗方法

  3.1 轉染前一天,接種細胞到完全培養基中培養,使細胞在轉染當天處于對數生長期。

  3.2 轉染復合物的準備。

  3.3 轉染:加入轉染混合物到細胞懸液中,輕柔混勻后培養至細胞活率降到50%以下收樣。

  3.4 收集表達后的細胞液,將培養基上清標記為culture medium;細胞加入1×PBS混勻,超聲后離心,上清吸至新的EP管中,標記為NPE,沉淀加入1×PBS(含8M尿素),混勻,標記為DPE。

  3.5 鎳柱親和純化:

  3.5.1 用PBS,pH 7.5緩沖液平衡鎳柱,以0.5 ml/min流速上樣;

  3.5.2 用Wash-Buffer以1 ml/min流速沖洗;

  3.5.3 用Elution-Buffer以1 ml/min流速洗脫目的蛋白,收集流出液;

  3.5.4 將上述收集的蛋白溶液放入透析袋中,使用PBS(pH 7.5)進行透析過夜;

  3.5.5 進行SDS-PAGE分析。

四、實驗結果

  4.1 蛋白鎳柱親和純化樣品SDS-PAGE分析:

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  4.2純化后樣品濃縮透析之后進行SDS-PAGE分析:

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  結論:目的蛋白已成功表達純化,并且純化得到的蛋白純度較高,在90%以上。

五、樣品信息

蛋白 濃度 規格 數量 總量
重組蛋白A 2.5 mg/ml 1.00 ml/vial 2 vials 5.00 mg

六、結論

  目的蛋白表達量為62.5 mg/L, 純度大于90%。

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