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酵母表達系統

服務簡介

畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統是近年來發展迅速、應用廣泛的一種真核表達系統。它是甲醇營養型酵母菌,有兩個乙醇氧化酶(Alcohol oxidase,AOX)編碼基因AOX1和AOX2,兩者序列相似,AOX1基因嚴格受甲醇誘導和調控。當甲醇為唯一碳源時,AOX1啟動子可被甲醇誘導,啟動乙醇氧化酶的表達,從而用甲醇進行代謝,含AOX1啟動子的質??捎脕泶龠M編碼外源蛋白的目的基因的表達。

主要優勢:

1.含有特有的強有力的AOX(醇氧化酶基因)啟動子,用甲醇可嚴格地調控外源基因的表達

2.產物易分離,畢赤酵母所用發酵培養基十分廉價,一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇,其余為無機鹽,培養基中不含蛋白,有利于下游產品分離純化

3.外源蛋白基因遺傳穩定,外源基因能以高拷貝數整合到畢赤酵母基因組中,不易丟失并能夠得到高表達菌株

4.作為真核表達系統,畢赤酵母具有真核生物的亞細胞結構,具有糖基化、脂肪?;?、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能

表達菌株特點:

GS115:AOX1和AOX2基因都正常表達AOX蛋白(乙醇氧化酶),甲醇的利用效率高,接近于野生型,屬于甲醇快速利用型(Mut+)

KM71:AOX1基因被大部分剔除,只能利用AOX2為AOX編碼,甲醇利用速率變慢,表現為甲醇慢利用型(Muts)

外源基因的整合方式不同會導致表達菌株的表型不同:

Table 1. 酵母菌株表型

限制酶 插入位點 GS115 表型 KM71 表型
Sa1 I/StuI HIS4 HIS+Mut+ HIS+Muts
SacI 5’AOX1 HIS+Mut+ HIS+Muts
Bg1 II 取代AOX1 HIS+Muts HIS+Muts

 

Table 2. 表達載體信息

表達類型 載體名稱 篩選標記 啟動子
胞內表達 pAO815 HIS4 AOX1
pPIC3K HIS4 AOX1
pPIC3.5K HIS4 AOX1
分泌表達 pPICZα,A,B,C bler AOX1
pPIC9K HIS4 AOX1

 

 

對于胞外表達的蛋白除了可以用載體自帶的信號肽,還有以下信號肽可供選擇:

Table 3 . 信號肽序列

信號肽 蛋白序列
AlphaMF* MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA
Dse4 MSFSSNVPQLFLLLVLLTNIVSG
Exg1 MNLYLITLLFASLCSA
Scw11 MLSTILNIFILLLFIQASLQ
SAlb MKWVTFISLLFLFSSAYS

 

服務優勢

1.具有完備的畢赤酵母表達平臺,可以根據蛋白特性或客戶需求設計不同的實驗方案

2.具有高通量篩選平臺,可以快速有效地獲得最佳表達條件

3.具有大規模發酵生產的能力

服務內容

服務內容 客戶提供 服務步驟 服務周期 交付內容
畢赤酵母表達蛋白 基因序列
載體
菌株
基因合成,密碼子優化 2-4周

蛋白樣品

技術服務報告

亞克隆 1周
蛋白表達測試,高通量篩選 2-3周
發酵純化 1-2周

案例展示

案例1:

  蛋白A全長基因合成后亞克隆至表達載體pPICZαA,轉化畢赤酵母菌株X33,蛋白分泌表達成功(28kDa;C端6*His),產量7mg/L,純度大于90%,質檢圖如下:

酵母表達系統

蛋白A 純化質檢圖(Reduced SDS-PAGE)

 

案例2:

  蛋白B基因合成后亞克隆至表達載體pPIC3.5K分別轉化畢赤酵母菌株GS115/KM71進行胞內表達,SDS-PAGE檢測結果顯示蛋白B(糖基化后40kDa)有明顯表達,其中克隆GS115-5#(24h,0.5%甲醇),GS115-2#(48h,1%甲醇),GS115-3#(48h,1%甲醇)都能成功表達目的蛋白。

酵母表達系統

蛋白 B 表達測試圖(Reduced SDS-PAGE)

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